3.6 Методы выявления механизмов резистентности, имеющих клиническое и эпидемиологическое значение

Выявление отдельных механизмов и детерминант (генетических маркеров) резистентности за исключением редких случаев (например, выявления mecA/mecC у стафилококков [45] ) не заменяет фенотипическое определение чувствительности, поскольку фенотип резистентности может быть связан с наличием множества различных генетических факторов, в том числе, неизвестных. Однако определение механизмов резистентности имеет важное значение, как для выбора и оптимизации АМТ у отдельных пациентов, так и для долгосрочного мониторинга антибиотикорезистентности [46] . Несмотря на кажущиеся различия, эти цели являются тесно взаимосвязанными, поскольку накопление регулярных (рутинных) данных о выявлении микроорганизмов с важными механизмами резистентности у отдельных пациентов со временем формирует пул эпидемиологических данных, которые, в свою очередь, позволяют оценивать риски и вероятность возникновения инфекций, вызванных «проблемными» резистентными возбудителями, и выбирать наиболее эффективные препараты, в том числе для эмпирического применения, у других пациентов (в отделении, стационаре, регионе, и т.д.).

В подавляющем большинстве случаев стандартные фенотипические методы позволяют проводить эффективную и комплексную оценку чувствительности к антибиотикам. Однако в отдельных случаях стандартные методы определения чувствительности к антибиотикам являются недостаточно эффективными или субоптимальными для выявления определенных механизмов и детерминант резистентности вследствие вариабельности их фенотипического проявления in vitro (например, устойчивости к карбапенемам у энтеробактерий, вызванной продукцией OXA-48), или являются длительными, трудоемкими либо недоступными (например, для выявления мутационной устойчивости микобактерий к различным препаратам [47] , или мутационной устойчивости патогенных для человека микоплазм к макролидам и фторхинолонам). В таких случаях выявление генетических маркеров резистентности является более эффективным или более доступным для предсказания АР.

В то же время определение конкретного механизма резистентности часто невозможно только на основании оценки профиля чувствительности, особенно в рутинной практике. Например, дифференциация мутационных (утрата/изменение поринов, активация эффлюкса) и ферментативных (продукция карбапенемаз) механизмов устойчивости к карбапенемам у Pseudomonas aeruginosa или Klebsiella pneumoniae является важной (как для выбора терапии, так и для определения эпидемиологической значимости), но может быть крайне затруднительной или невозможной на основании оценки антибиотикограммы (спектра и уровня устойчивости к антибиотикам). В связи с этим выявление наиболее важных механизмов и детерминант резистентности требует использования дополнительных методов, фенотипических или молекулярно-генетических [48] [49] [50] .

3.6.1 Основные механизмы и детерминанты резистентности подлежащие мониторингу

В настоящее время новые технологии, включая методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) и секвенирования, становятся более доступными для практического использования в области клинической микробиологии благодаря техническому усовершенствованию, автоматизации и снижению стоимости. Эти методы позволяют осуществлять выявление любых известных детерминант (генов и мутаций), связанных с АР. Важным преимуществом МАНК является возможность быстрого определения детерминант резистентности не только у микробных изолятов, выделенных в чистой культуре, но и в образцах нативного биоматериала или положительных гемокультур. Однако с практической точки зрения наиболее важным является выявление отдельных механизмов, которые имеют особое клиническое и/или эпидемиологическое значение. Такие механизмы и методы их выявления подробно описаны в руководстве «The EUCAST guidelines for detection of resistance mechanisms and specific resistances of clinical and/or epidemiological importance» [51] , а также в руководствах Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по использованию молекулярно-генетических методов и геномного секвенирования в системе мониторинга антибиотикорезистентности [52] [53] .

Для осуществления эффективного контроля за распространением инфекций и обеспечения рационального применения антибиотиков в стационаре наиболее важным является мониторинг следующих механизмов и детерминант резистентности:

  • приобретенных карбапенемаз у Enterobacterales, P. aeruginosa и Acinetobacter;
  • β-лактамаз расширенного спектра у Enterobacterales;
  • mcr-опосредованной (плазмидно-кодируемой) резистентности к полимиксинам у Грам(-) бактерий;
  • mecA/mecC-опосредованной резистентности к беталактамам у S. aureus;
  • vanA/vanB-опосредованной резистентности к гликопептидам у E. faecium и E. faecalis.

Спектр выявляемых в каждой лаборатории механизмов и детерминант резистентности может отличаться и должен учитывать локальные, региональные и национальные данные о распространенности фенотипической резистентности и отдельных генетических маркеров. Он может изменяться и дополняться со временем в случае выявления новых значимых механизмов (например, в случае распространения штаммов стафилококков, устойчивых к оксазолидинонам, должен осуществляться мониторинг плазмидных Cfr рРНК метилтрансфераз).

3.6.1.1 Выявление приобретенных карбапенемаз у Enterobacterales, P. aeruginosa и Acinetobacter

Карбапенемазы – крайне разнородная группа бактериальных ферментов, относящихся к трем молекулярным классам A, B и D и множеству генетических групп, которые отличаются от других β-лактамаз способностью расщеплять карбапенемы. Продукция карбапенемаз является наиболее эффективным и эпидемиологически значимым механизмом резистентности к карбапенемам у Грам(-) бактерий [54] [55] . У Pseudomonas и Acinetobacter spp. наличие приобретенных карбапенемаз обычно коррелирует с фенотипической устойчивостью к карбапенемам, однако карбапенемазопродуцирующие энтеробактерии (CPE) могут проявлять «чувствительность» к меропенему и имипенему при тестировании in vitro в соответствии с клиническими пограничными значениями МПК и ДДМ для резистентных штаммов. С другой стороны, резистентность низкого уровня к карбапенемам у энтеробактерий может быть вызвана альтернативными механизмами, которые имеют меньшее клиническое и эпидемиологическое значение. При наличии результатов определения чувствительности выявление продукции карбапенемаз должно проводиться не только для резистентных штаммов, но для всех изолятов Enterobacterales с МПК меропенема >0,125 мг/л или диаметром зоны подавления роста вокруг диска с меропенемом (10 мкг) <28 мм. В стационарах с высоким уровнем распространенности СРЕ выявление продукции карбапенемаз может проводиться для всех изолятов энтеробактерий до получения данных о чувствительности к карбапенемам. При наличии у пациента факторов риска инфицирования СPE выявление генов карбапенемаз может также осуществляться с использованием амплификационных молекулярно-генетических методов (МАНК) в образцах нативного биоматериала или положительных гемокультур до выделения возбудителя в чистой культуре [56] .

Методы выявления карбапенемаз включают [57] :

  • Методы определения чувствительности к карбапенемам и их комбинациям с различными ингибиторами («двойные», «комбинированные » диски или определение МПК в присутствии ингибиторов) – оценка синергизма. В связи с необходимостью использования различных ингибиторов и относительно низкой специфичностью данные методы в настоящее время имеют ограниченное применение.
  • Иммунохроматографические методы. Позволяют выявлять продукцию и дифференцировать наиболее распространенные типы карбапенемаз у микробных изолятов.
  • Методы оценки in vitro гидролиза карбапенемов с использованием индикаторного штамма (CIM, eCIM, mCIM), MALDI-ToF масс-спектрометрии, pH-индикаторов (Carba-NP тест и др.), флуорогенных карбапенемов (СarbaLux).
  • МАНК (ПЦР-РВ и др.) и методы секвенирования.

Использование селективных и хромогенных сред позволяет осуществлять предварительный скрининг изолятов энтеробактерий с вероятной продукцией карбапенемаз, но не является специфическим методом выявления их продукции. Рост бактериальных изолятов на селективных средах, содержащих карбапенемы, может быть связан с наличием различных механизмов помимо продукции карбапенемаз. Наличие карбапенемаз должно быть подтверждено с помощью тестов, перечисленных выше. Многие неферментирующие бактерии (Acinetobacter, Pseudomonas и др.) способны расти на селективных средах, предназначенных для выявления CPE, в отсутствии приобретенных механизмов устойчивости к карбапенемам.

При использовании МАНК важно учитывать данные распространенности различных типов карбапенемаз, которые могут существенно отличаться для разных видов бактерий и разных географических регионов (Таблица 3.6.1.).

Таблица 3.6.1. Встречаемость различных карбапенемаз у Enterobacterales, P. aeruginosa и Acinetobacter spp. в России [55] [58] [59]

Молекулярный тип карбапенемаз Enterobacterales P. aeruginosa Acinetobacter spp.
VIM + ++++ +
IMP + + +
NDM +++ + +
OXA-48 ++++ - -
OXA-23 - - ++++
OXA-24/40 - - ++++
OXA-58 - - ++
KPC ++ - -
GES-5 (G170S) 1 - +++ -

1 коммерческие тесты для дифференциации ESBL и карбапенемаз группы GES в настоящее время недоступны в России.

3.6.1.2 Выявление ESBL у Enterobacterales

β-Лактамазы расширенного спектра (ESBL) – ферменты, гидролизующие пенициллины, цефалоспорины I-IV поколения и азтреонам, но не гидролизующие цефамицины и карбапенемы. Большинство ESBL относятся к молекулярному классу А и подавляются «классическими» ингибиторами (клавулановой кислотой, сульбактамом, тазобактамом), а также авибактамом. Продукция ESBL встречается у всех клинически значимых видов энтеробактерий, как в стационарах, так и во внебольничной среде.

Методы выявления ESBL включают:

  • Методы определения чувствительности к оксииминобеталактамам и их комбинациям с клавулановой кислотой («двойные», «комбинированные» диски или определение МПК в присутствии клавулановой кислоты – оценка синергизма).
  • Методы оценки in vitro гидролиза оксииминобеталактамов с использованием индикаторного штамма (модифицированный CIM тест), MALDI-ToF масс-спектрометрии, pH-индикаторов.
  • Иммунохроматографические методы. Позволяют выявлять продукцию и наиболее распространенных ESBL группы CTX-M у микробных изолятов.
  • МАНК (ПЦР-РВ и др.) и методы секвенирования.

ESBL относятся к множеству различных генетических групп (семейств). Поэтому для универсальной детекции ESBL в основном используются фенотипические тесты, основанные на выявлении синергизма оксииминобеталактамов с клавулановой кислотой. Наиболее распространенными в настоящее время являются ферменты CTX-M-группы, которые, в свою очередь, делятся на генетические кластеры CTX-M-1-, CTX-M-2-, CTX-M-8/25- и CTX-M-9-родственных ферментов (самые частые варианты CTX-M-15, -3, -9 и -14 относятся к кластерам CTX-M-1 и CTX-M-9). Реже встречаются ESBL SHV-типа (SHV-2, -5, -12 и др.) которые представляют собой мутантные производные SHV пенициллиназ (SHV-1, -11 и др.) – видоспецифических ферментов K. pneumoniae. ESBL TEM-типа являются мутантными производными широко распространенных плазмидно кодируемых TEM пенициллиназ. В России ESBL TEM-типа встречаются крайне редко, несмотря на то, что пенициллиназы (TEM-1 и др.) присутствуют у подавляющего большинства клинических штаммов. Доступные в настоящее время в России диагностические тесты на основе МАНК позволяют выявлять только гены CTX-M ESBL, но не позволяют дифференцировать мутантные варианты SHV и TEM с расширенным спектром активности. Поэтому использование молекулярно-генетических методов не заменяет фенотипическое тестирование для обнаружения ESBL. Тем не менее, МАНК, включая ПЦР-РВ, могут применяться для быстрой детекции генов CTX-M β-лактамаз, например, в образцах нативного биоматериала и положительных гемокультур.

3.6.1.3 Выявление mcr-опосредованной резистентности к полимиксинам у Грам(-) бактерий

Гены mcr кодируют фосфоэтаноламин-трансферазы, ферменты, осуществляющие модификацию липида A – основного структурного компонента липополисахарида (ЛПС) и вызывающие устойчивость к полимиксинам. Гены mcr имеют плазмидную локализацию и могут распространяться горизонтально между различными штаммами и видами Грам(-) бактерий. В настоящее время описано множество генетических вариантов mcr, которые относятся как минимум к семи различным генетическим кластерам. Происхождение mcr связано с мобилизацией и переносом на плазмиды хромосомных генов Moraxella (mcr-1,-2), Aeromonas veronii (mcr-3), Shewanella (mcr-4) 23, Raoultella ornithinolytica (mcr-8) и Salmonella enterica ser. Typhimurium (mcr-9). Ген mcr-1, описанный первым, является наиболее распространенным у энтеробактерий, прежде всего, у штаммов E. coli, выделяемых от животных, человека и из окружающей среды. Распространенность плазмидных mcr среди клинических штаммов варьирует в разных странах и регионах, но обычно не превышает распространенность других механизмов резистентности к полимиксинам (модификации ЛПС, эффлюкса), связанных с мутациями в хромосомных генах. В связи с этим детекция mcr имеет в основном эпидемиологическое значение (из-за возможности горизонтального распространения).

Методы выявления mcr включают:

  • МАНК (ПЦР-РВ и др.) и методы секвенирования.
  • Иммунохроматографические методы. Позволяют выявлять экспрессию mcr-1 у микробных изолятов.
  • Методы определения чувствительности к полимиксинам в присутсвии цинк-хелатирующих ингибиторов mcr (ЭДТА, дипиколиновой кислоты).

Другие методы, применяемые для ускоренной диагностики резистентности к полимиксинам, например, оценка роста на селективных средах или в присутствии pH индикаторов (polymyxin NP test), детекция модификаций липида А с помощью MALDI-ToF масс-спектрометрии (MALDIxin тест), не являются специфичными для mcr.

3.6.1.4 Выявление mecA/mecC-опосредованной резистентности к беталактамам у Staphylococcus aureus

Наличие гена mecA, который кодирует дополнительный пенициллин-связывающий белок (ПСБ2а/2’) с низкой аффинностью к беталактамам, является основным механизмом устойчивости Staphylococcus aureus и других видов стафилококков ко всем беталактамам (кроме цефтаролина и цефтобипрола). Помимо mecA штаммы S. aureus, проявляющие фенотип метициллинорезистентности (MRSA), выделяемые от животных и реже от человека, могут нести ген mecC, кодирующий альтернативный вариант ПСБ2а. Гены mecA и mecC входят в состав генетических элементов, известных как стафилококковые хромосомные кассеты mec (SCCmec), и часто ассоциированы с генами резистентности к другим антибиотикам. S. fleurettii и S. xylosus содержат видоспецифические гены ПСБ, гомологичные mecA и mecC. SCCmec элементы, несущие эти гены, также широко распространены у других видов стафилокков.

Методы выявления mecA/mecC-опосредованной резистентности включают:

  • Определение МПК оксациллина или цефокситина, скрининг чувствительности к цефокситину с использованием ДДМ.
  • МАНК (ПЦР-РВ и др.) и методы секвенирования.
  • Латексная агглютинация. Позволяет выявлять ПСБ2a у микробных изолятов, выделенных в чистой культуре.

Выявление mecA/mecC с помощью МАНК является референтным методом детекции MRSA и метициллинорезистентности у других видов стафилококков (MRS) [60] [61] . Несмотря на то, что до настоящего времени в России не были выявлены штаммы, несущие ген mecC, для мониторинга MRSA рекомендуется использовать тесты, обеспечивающие возможность его детекции наряду с mecA. Важным при использовании МАНК для прямого выявления mecA/mecC в клинических образцах является также возможность определения вида возбудителя, который является их источником (S. aureus или другие стафилокки), особенно при анализе колонизации MRSA, поскольку коагулазонегативные стафилококки, колонизирующие кожу и верхние дыхательные пути, являются более частым источником mec генов.

3.6.1.5 Выявление vanA/vanB-опосредованной резистентности к гликопептидам у Enterococcus faecium и E. faecalis

Гены vanA и vanB являются основными детерминантами резистентности к гликопептидам (ванкомицину) у E. faecium и реже у E. faecalis. Они входят в состав мобильных генетических кластеров, которые кодируют синтез измененных мишеней – пептидных остатков (-D-аланил-D-лактат) с низкой аффинностью связывания ванкомицина. Другие редкие приобретенные гены vanD и vanE, а также видоспецифические гены vanC E. gallinarum, E. casseliflavus и E. flavescens имеют меньшее клиническое и эпидемиологическое значение.

Методы выявления vanA/vanB-опосредованной резистентности включают:

  • Определение МПК ванкомицина.
  • МАНК (ПЦР-РВ и др.) и методы секвенирования.

Распространенность устойчивости к ванкомицину, связанной с vanA/vanB, значительно отличается в разных странах. В России резистентность к ванкомицину в основном встречается у нозокомиальных штаммов E. faecium в стационарах онкологического и гематологического профиля и значительно реже в других стационарах. Мониторинг vanA и vanB является важным в случае увеличения частоты обнаружения ванкомицинорезистентных энтерококков (VRE).

3.6.2 Учет и регистрация данных выявления механизмов и детерминант резистентности

3.6.2.1 Номенклатура и стандартизация

Стандартизация записей результатов исследования является абсолютно необходимой для их обобщения и автоматического анализа. В различных источниках и базах данных для обозначения одних и тех же генетических детерминант резистентности могут использоваться разные названия. Например распространенный ген aadA1, кодирующий аминогликозид-аденилтрансферазу ANT(3’’)-Ia, может также обозначаться как aadA, aadA1-pm, или aad(3’’). В связи с этим для указания генетических маркеров устойчивости к АМП (генов и мутаций) рекомендуется использовать единую международно принятую номенклатуру и базы данных AMRFinderPlus или ResFinder/PointFinder [62] [63] .

Гены и кодируемые ими ферменты, как правило, обозначаются по-разному, например, гены группы blaVIM и кодируемые ими металло-β-лактамазы группы VIM. При учете результатов необходимо соблюдать единообразие записей.

3.6.2.2 Информативность результатов

Разные методы обеспечивают разную точность указания вариантов (типов) детерминант резистентности. В частности, ПЦР обычно позволяет выявить ген и установить его принадлежность к определенной группе, в то время как методы секвенирования позволяют установить точный вариант (например, группа blaOXA-48, тип blaOXA-244). В различных ситуациях точность указания группы или конкретного варианта гена или мутации могут иметь разное значение. Например, результат выявления гена «blaOXA» без указания группы или определенного варианта является неинформативным, поскольку это обозначение является общим для разных генов, кодирующих природные и приобретенные β-лактамазы класса D с разным спектром активности: пенициллиназы, цефалоспориназы и карбапенемазы. В то же время, указание наличия гена группы blaNDM является достаточным для определения металло-β-лактамазы, которая вызывает устойчивость к пенициллинам, цефалоспоринам и карбапенемам.

3.6.2.3 Организация записей

Результаты выявления одних и тех же механизмов или детерминант, полученные с использованием разных методов, например, ПЦР, секвенирования, фенотипических тестов, рекомендуется записывать отдельно (в разных столбцах таблицы или полях базы данных). Примеры учета результатов определения детерминант резистентности представлены в Таблице 3.6.2.

В случае если один тест позволяет выявлять и дифференцировать несколько детерминант (например, мультиплексная ПЦР для детекции генов разных карбапенемаз), рекомендуется учитывать результат обнаружения каждой из них отдельно. Результаты выявления и аннотации множества детерминант, полученные с помощью методов геномного секвенирования (WGS), могут быть записаны в виде одной строки с разделителями между названиями отдельных генов или мутаций.

Анализ механизмов резистентности обычно проводится не для всех, а для определенных или выборочных изолятов. В связи с этим учет отрицательных результатов тестов столь же важен, как и положительных. Учет отрицательных результатов позволяет впоследствии различать случаи, когда соответствующие детерминанты резистентности отсутствовали у микробных изолятов, и когда тестирование не производилось, и, таким образом, правильно оценивать истинную распространенность детерминант.

Выявление с помощью МАНК маркера резистентности непосредственно в клиническом образце из локуса, который в норме не является стерильным, не означает его обязательное наличие у микробного изолята, который может быть выделен из данного локуса. Например, одновременное обнаружение с помощью ПЦР генов группы blaOXA-48 и blaVIM в эндотрахеальном аспирате и последующее выделение в культуре изолятов K. pneumoniae и P. aeruginosa не позволяет констатировать факт наличия у каждого из этих изолятов генов двух карбапенемаз. Каждый выделенный изолят должен быть исследован на наличие карбапенемаз, и результаты представлены отдельно.

Таблица 3.6.2. Примеры учета результатов определения детерминант резистентности

ID Вид МО ПЦР_NDM ПЦР_VIM ПЦР_IMP ПЦР_OXA-48-гр. ПЦР_KPC CIM-тест ESBL_ДД WGS_генотип
1 Klebsiella pneumoniae Отр. Отр. Отр. Положит. Отр. Положит. Положит. blaSHV-11|blaTEM-1|blaCTX-M-15|blaOXA-244|fosA|aadA2|qacEdelta1|sul1
2 Pseudomonas aeruginosa Отр. Положит. Отр. Отр. Отр. Положит. Нет данных Нет данных
3 Escherichia coli Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Положит. Нет данных

Изменено 27 сентября 2021